The application of CRISPR/Cas system in plant genome editing
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...果表明，KOD酶的扩增效果最佳，但 CEL Ⅰ酶 在该体系中的切割效果不理想。B Taq酶体系和 r Taq酶体系中 PCR扩增效果差，电泳检测时不能 看见 1 000 bp处的条带。LA Taq酶体系能够扩增 到 dep1 片段，且 CEL Ⅰ酶在该体系中表现出了 切割活性。进一步通过采用 LA buffer 与不同的 Taq 酶组合，发现 B Taq 与 LA buffer组合可以 提高 PCR 的效率和保证 CEL Ⅰ的酶切活性。 2.4 CEL Ⅰ酶对 CRISPR介导的 stn1 基因敲 除株突变进行分型 采用农杆菌介导的方法，我们将 stn1-CRISPR 转化水稻，获得 35个独立的转基因株系。由于转 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech May 25, 2017 Vol.33 No.5 http://journals.im.ac.cn/cjbcn 780 基因株中可能含有无突变、杂合突变、纯合突变 及双位点突变等多种类型，我们根据 CEL Ⅰ酶能 切割异源 DNA双链的特点，设计了两种方法对上 述类型进行区分：1) 将 PCR 产物直接变性、复 性、酶切；2) 将 PCR 产物与野生型植株的 PCR 产物等量混合，变性、复性，再用 CEL Ⅰ酶切。 stn1-1和 stn1-4是通过的 stn1-CRISPR转化获得 的两个突变株系。其中 stn1-1的 PCR产物变、 复性后可以被 CEL Ⅰ酶切割，其 PCR产物与野 生型植株 PCR 产物混合变、复性后也可以被 CEL Ⅰ酶切割，说明突变株为杂合突变或双位 点突变。stn1-4 的 PCR 产物变、复性后不能被 CEL Ⅰ酶切割，其 PCR产物与野生型植株 PCR 产物混合变、复性后可以被 CEL Ⅰ酶切割，说 明该突变株为纯合突变。对上述两个突变株 PCR 产物进行克隆，转化大肠杆菌并挑单克隆 进行测序，结果表明 stn1-1 突变株存在两种突 变类型 (–3 bp/–1 bp)，而 stn1-4为单碱基缺失的 纯合突变 (–1 bp/–1 bp)。以上结果表明，CEL Ⅰ 酶不仅可以快速鉴定突变体，而且可以对不同的 类型进行有效区分 (图 5)。 2.5 CEL Ⅰ酶策略检测 CRISPR 介导的 stn1 基因突变株及验证 为验证 CEL Ⅰ酶策略检测的正确率，利用 该策略对 CRISPR介导的 stn1突变的 T0代植株 (已测序) 进行酶切检测。结果表明，其中#4、 #9、#17 为纯合突变植株，#8 为野生型植株， 其余植株为杂合体或双等位突变体或嵌合体 (图 6)。CEL Ⅰ酶检测结果与测序结果对比完全 一致。以上结果表明利用 CEL Ⅰ酶策略在本次 实验中的正确率达 100%，表明该方法是一种非 常理想的检测 CRISPR突变株的方法。 图 5 CEL Ⅰ酶检测两种不同突变类型的突变株 (A：stn1-1 和 stn1-4 两种突变株的测序结果；B：利用 CEL Ⅰ 酶策略检测杂合和纯合突变株) Fig....
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...http://journals.im.ac.cn/cjbcn Keywords: CELⅠ crude extracts, CRISPR/Cas9, mutant, identification, stn1 随着测序技术的发展，许多物种的全基因 组测序工作已经完成。阐明基因的功能及构建 基因调控和互作网络成为现阶段的主要任务。 构建基因突变个体是十分有效的基因功能研究 手段。基因组编辑技术的出现，使得快速、高 效地定点突变目的基因成为可能。 CRISPR/Cas9系统是细菌的免疫系统，其主 要作用是防御外来质粒或噬菌体 DNA 的入侵。 科学家在大肠杆菌发现了特殊的成簇的规律间 隔的短回文重复序列[1]，并于 2002年正式将其命 名为 CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)[2]。2013年，Science杂 志同期刊登了两篇关于 CRISPR/Cas9 介导的基 因敲除的文献，首次报道了 CRISPR/Cas9系统可 用于人类和小鼠细胞的基因组编辑，证明了 CRISPR技术可用于编辑高等真核基因组[3-4]。此 后，CRISPR技术也被应用到植物基因组编辑中， 并在模式植物拟南芥、烟草以及小麦、水稻、高 粱、玉米等重要农作物中获得成功[5-10]，并且证 明了产生的编辑可以在植物中稳定遗传[11]。此 外，基因编辑过的植物可以通过自交、回交等 手段，获得不带 CRISPR元件的基因编辑株[12]。 CRISPR/Cas9引入突变的方式是通过 sgRNA识 别靶位点，利用 Cas9的核酸内切酶活性使靶位 点DNA的双链发生断裂 (Double-strand breaks， DSBs)，从而激活个体自身修复机制。编辑个体 可以通过非同源末端连接介导的修复方式 (Non-homologous end joining，NHEJ) 和同源重 组介导的修复方式 (Homology-directed repair， HDR) 对双链断裂处进行修复[13]。通过 NHEJ 介导的修复方式进行修复时，断裂的 DNA末端 重新连接，这种非精确的修复会导致在断裂位 罗婉冰 等/采用 CEL Ⅰ酶粗提物高效鉴定 CRISPR/Cas9 介导的基因突变 ☏：010-64807509 ：cjb@im.ac.cn 777 置上产生少量核苷酸的插入或删除，进而产生 突变[14]。CRISPR技术与传统基因打靶技术相比 突变效率更高，与 ZFN、TALEN等基因组编辑 技术相比具有耗时更短、操作简单等特点，因 此已被广泛用于突变体的构建。由于编辑效率 的限制，通过 CRISPR 技术产生的大量编辑个 体仍需通过进一步的筛选鉴定，因此建立快速、 高效和低成本的鉴定体系尤为重要。 CELⅠ酶是芹菜中发现的可以特异识别 DNA 双链中的错配位点并切割双链的核酸内切 酶[15]。研究表明，芹菜 CEL Ⅰ酶粗提物可以用 于点突变的检测[16-17]。利用该酶的特点，可以 有效鉴定 CRISPR 突变体。本文以水稻为材料 构建了 dep1 基因和 stn1 基因的突变体，利用 CEL Ⅰ酶粗提物进行鉴定，并对鉴定条件进行 了优化，将 PCR反应、产物变性、复性处理和 CEL Ⅰ酶切整合在一管中进行，结合琼脂糖凝 胶电泳，建立了一种快速、高效和廉价的突变 体检测系统。 1 材料与方法...
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...1 Physical map of CRISPR vector and CRISPR target site of stn1....
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...手段,获得不带 CRISPR元件的基因编辑株([12])。 CRISPR/Cas9引入突变的方式是通过 sgRNA识 别靶位点,利用 Cas9的核酸内切酶活性使靶位 点DNA的双链发生断裂 (Double-strand breaks, DSBs),从而激活个体自身修复机制。编辑个体...
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...ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech May 25, 2017 Vol.33 No.5 http://journals.im.ac.cn/cjbcn 778 表 1 本研究所用的引物 与 Bsa Ⅰ酶切的载体相连接，转化大肠杆菌，提 取阳性菌株的质粒，测序。将确认无误的质粒转 入农杆菌 EHA105，获得含有用于水稻 stn1突变 的农杆菌菌株 EHA105/CRISPRstn1。 1.2.3 农杆菌介导转化水稻 参照 Li等[18]的方法，利用农杆菌 EHA105/ CRISPRstn1转化水稻品种中花 11的愈伤组织， 用潮霉素筛选获得再生组培苗。组培苗经炼苗 后，移栽盆钵，即为 T0代植株。按转基因水稻 种植要求严格管理。 1.2.4 扩增 dep1及 stn1突变位点所在片段 提取水稻叶片的基因组 DNA，以引物组合 dep1-Fw/dep1-Re和 stn1-Fw/stn1-Re进行 PCR扩 增，理论产物长度约为 948 bp和 491 bp。反应体 系包括基因组 DNA 1μL，10×PCR缓冲液 2.5 μL， dNTPs (2 mmol/L) 2.5 μL，上游引物 (10 μmol/L) 1 μL，下游引物 (10 μmol/L) 1 μL，DNA polymerase 1 U，补去离子水到 25 μL。PCR反应的参数设 置如下：94 ℃预变性 5 min，然后进行 35个循 环的 PCR扩增 (94 ℃，30 s；退火温度，30 s； 72 ℃，1 min)，最后 72 ℃延伸 10 min。其中 stn1 退火温度为 65 ℃，dep1的退火温度为 55 ℃。 1.2.5 CEL Ⅰ酶粗提物切割 PCR产物 转化株 DNA经 PCR 扩增后，将产物(或加 入等量的野生型 DNA扩增产物) 进行变、复性 处理，再向其中加入 CEL Ⅰ酶，42 ℃温育，用 EDTA终止反应。取 10 μL样品进行电泳检测。 2 结果与讨论 2.1 CEL Ⅰ酶粗提物用于突变体的检测 dep1 是水稻直立密穗控制基因[23]，本论文 dep1-29突变株由本实验室创制，测序结果表明， 该植株为双位点突变 (–2/–5) (图 2)。为检测 CEL Ⅰ酶粗提物是否能切割异源双链 DNA，取 1 μL CEL Ⅰ酶粗提物直接加入到经变性、复性 处理的 PCR样品中，与不加 CEL Ⅰ酶的样品进 行对比。电泳结果显示 CEL Ⅰ酶可以切割异源 双链 DNA，切出条带符合预期大小，证明 CELⅠ 酶粗提物适用于点突变的检测。 图 2 dep1-29 突变株突变位点的测序结果和 CEL Ⅰ 酶切检测结果 (dep1-29 a 和 dep1-29 b 表示 dep1-29 突变株包含双等位突变的两种突变类型) Fig....
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