Clostridium perfringens type D produces enterotoxemia, an enteric disease in ruminants, also known as pulpy kidney disease. Caused by epsilon toxin, enterotoxemia is a major exotoxin produced by this microorganism. Epsilon toxin is also the main component of vaccines against this enteric disorder. In this study, a standardized dot-blot was used to choose strains of C. perfringens type D that are producers of epsilon toxin. Clones producing epsilon toxin were chosen by limiting dilution; after three passages, lethal minimum dose titers were determined by soroneutralization test in mice. These clones produced epsilon toxin 240 times more concentrated than the original strain. The presence of the epsilon toxin gene (etx) was verified by polymerase chain reaction. All clones were positive, including those determined to be negative by dot-blot tests, suggesting that mechanisms in addition to the presence of the etx gene can influence toxin production. The dot-blot test was efficient for the selection of toxigenic colonies of C. perfringens type D and demonstrated that homogeneous populations selected from toxigenic cultures produce higher titers of epsilon toxin.

Selection of a Clostridium perfringens type D epsilon toxin producer via dot-blot test.

Enterotoxemia, tambem chamada de doenca do rim pulposo, doenca que acomete os ruminantes domesticos, e causada pela acao da toxina epsilon produzida pelo Clostridium perfringens tipo D, um anaerobio comumente isolado do solo e das fezes de animais sadios. O metodo tradicional de diagnostico baseia-se na deteccao e classificacao dessa exotoxina no conteudo intestinal por meio da soroneutralizacao em camundongos. Com isso, o objetivo deste estudo foi padronizar um teste para deteccao e titulacao dessa toxina in vitro e compara-lo ao fenomeno in vivo. Para isso, uma partida de toxina epsilon de Clostridium perfringens tipo D foi titulada em camundongos e em varias linhagens continuas de celulas. Apos a determinacao da linhagem celular mais sensivel, realizaram-se ensaios de titulacao in vitro de diluicoes de uma partida de toxina, comparando-os com os titulos in vivo conhecidos. Os resultados foram agrupados, e foi desenvolvida a equacao matematica que melhor adaptou-se aos intervalos trabalhados. A linhagem MDCK, alem de mais sensivel, demonstrou que o fenomeno observado in vitro pode ser expresso por meio da equacao matematica que apresenta uma correlacao de 98,33%, com a dose minima mortal determinada in vivo. Portanto, a linhagem MDCK permite titular a toxina epsilon de C. perfringens tipo D de forma especifica e sensivel, alem de ser uma tecnica pratica, rapida e que dispensa o uso de animais.

/pdf/padronizacao-da-titulacao-da-toxina-epsilon-de-clostridium-31l7bzr3e3.pdf

Padronização da titulação da toxina épsilon de Clostridium perfringens tipo D em linhagem contínua de células como alternativa ao bioensaio animal

http://www.scielo.br/pdf/bjm/v48n3/1517-8382-bjm-48-03-0570.pdf

Mapping of the continuous epitopes displayed on the Clostridium perfringens type D epsilon-toxin.

Production and purification of Clostridium perfringens type D epsilon toxin and IgY antitoxin.

A simple method for purification of epsilon toxin of Clostridium perfringens type D for serum neutralization assay

A prototoxina epsilon foi obtida a partir de cultivo liquido, rico em carboidratos, a partir de amostra de C. perfringens tipo D (INTA - Argentina), incubado em condicoes de anarobiose a 37oC por oito horas. O sobrenadante da cultura foi concentrado utilizando-se o sistema Amicon com membrana de "cut off" de 10 kDa. O concentrado foi precipitado com sulfato de amonio (350 g/ml) e dissolvido em tampao fosfato 0,01 M (pH 7,2). A prototoxina purificada por cromatografia de troca ionica (DEAE-Sepharose CL 6B) e isolada no primeiro pico, mostrou uma banda unica de aproximadamente 34kDa de peso molecular em SDS-PAGE, alem de ser toxica em camundongos.

G.M. Balsamão

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Production and purification of epsilon prototoxin produced by Clostridium perfringens type D