In order to demonstrate the basophilic cell strain selectively, bone marrow smears were stained in aqueous toluidin blue solution at pH 4.

Appropriately fixed basophil cell-line can selectively be visualized by anionic dyes as toluidine blue. Typical activities for Leder's esterase distinguish individual maturity stages. Both methods were successively applied to bone marrow smears from 22 healthy subjects in order to assess the basophil population among the total marrow leukocytes (lymphocytes, monocytes and granulopoietic cell-lines) and the portion of each basophil maturity stages. Total basophils represent 0.45+/-0.13% of marrow leukocytes. Basophil precursors capable of division (promyelocytes and myelocytes) comprise 46.7%, mitoses 3.7+/-1.76% of the total marrow basophil population. The frequency distribution of these subpopulations approximated a normal distribution pattern. No clear central tendencies could be encountered in the dispersion of other stages. The low peripheral basophil counts, the high incidence of divisible precursors and the considerable mitotic activity suggest a short half-life time for blood basophils.

Cytophotometrische Messung der Aktivität von Naphthol-AS-D-Chloracetat-Esterase in den normalen menschlichen basophilen Granulopoiesezellen

[Quantitation of basophil cell-line in human bone marrow (author's transl)].

From the turn of the century two great hematological schools have dominated the literature concerning genesis and origin of blood basophils. On the one side are Ehrlich, Naegeli, Schridde, Ziegler, Turk, and Sabin and on the other Pappenheim, Weidenreich, and Grawitz. Repetitions, uncritical acceptance of hypotheses, and confusions in terminology all combine to impede an exact analysis of their work today. As there are already several works that aim to cover the history of this part of hematology (Michels, 1938; Sabin, 1940; Selye, 1965), we limit ourselves in the following pages to works that have been of decisive importance for an understanding of the cytogenesis of blood basophils.

The Origin of Blood Basophils

Granulozyten entwickeln sich aus Myeloblasten uber die Stadien Promyelozyt, Myelozyt, Metamyelozyt (Tabelle 1 und 2). Wahrend dieses Reifungsprozesses entwickeln sich Granula im Zytoplasma. Zuerst bilden sich unspezifische Granula, spater neutrophile, eosinophile oder basophile Granula. Myeloische Zellen entwickeln sich im Knochenmark, treten dann ins periphere Blut uber und werden zu den Geweben transportiert, wo sie ihre Funktionen erfullen konnen. Dabei werden zwei etwa gleich grose Kompartments von Granulozyten unterschieden, das zirkulierende und das marginale Kompartment. Unter dem marginalen Kompartment versteht man die Summe der an den Gefaswanden sitzenden Zellen, das zirkulierende Kompartment ist die Summe der zirkulierenden Zellen. Spezifische Granulozytenchalone steuern wahrscheinlich die Produktion von Granulozyten, so das sich zwischen Produktion und Verbrauch ein Gleichgewicht einstellt. Nur ein geringer Prozentsatz der Granulozyten geht im Blut zugrunde, der weitaus groste Teil wird in den Geweben verbraucht. Daher ist auch eine Berechnung von Fliesgleichgewichten sehr erschwert.

Myelopoese (Granulozyten, Monozyten)

Blutkrankheiten und Blutdiagnostik

The mast cells

1 Human myeloid cells in the peripheral blood and bone marrow contain a very strong esterase activity which can be demonstrated histochemically by the use of naphthol AS-D chloroacetate as substrate2 As first pointed out by Gomori, this esterase activity is found not only in segmented but also immature myeloid cells However, stem cells, cosinophilic and basophilic granulocytes, lymphocytes, monocytes, plasma cells, megakaryocytes, adult red cells and red cell precursors do not stain with this method3 Histocytes and mast cells are strongly positive for this esterase activity4 No differences in esterase activity have been noted thus far between neutrophilic leukocytes in normal individuals and in patients with chronic myclogenous leukemia or other diseases5 The leukocyte esterase activity is abolished by various well known inhibiting agents Activity in young myeloid cells in non-leukemic bone marrow smears and in the peripheral blood of patients with myeloid leukemia is inhibited less than that i

Esterase activity in leukocytes demonstrated by the use of naphthol AS-D chloroacetate substrate.

Fermenthistoehemische Untersuchungen yon Go~o~I (1953), Bv~aSTO~E (1957) sowie MOLO~EY, McPi~E~so~ and F L I ~ E L ~ (1960) ergaben, dab menschliehe Gewebsmastzellen und die ZelIen der normalen oder leuk~mischen neutrophilen Myelopoese mit Ausnahme der Myeloblasten Chloracylester mit einer Intensit~t spalten, die yon anderen Gewebskomponenten bci weitem nicht erreicht wird. Diese VerhMten gestattet die genannten Zellen fast elektiv darzustellen. Als fiir diesen Zweek besonders gut geeignet erwies sieh das Substrat I~aphthol-ASD-Ch]oraeetat. Bei methodischen Studien zum Nachweis der NaphtholASD-Chloracetat-Esterase zeigte sich, dub das Ferment auBerordentlich stabil und gegeniiber den Einfliissen histologiseher Teehnik weitgehend unempfindlieh ist. So konnten wir in mehr Ms zwei Jahre lang unfixiert und lufttroeken aufbewahrten Blutausstriehen erstaunlicherweise kein Naehlassen der NeutrophilenaktivitEt Ieststellen. Sogar troekenes, d. h. wasserfreies Erhitzen bis 100°C und auch die bei der routinem~Bigen Paraffineinbettang verwendeten organischen Verbindungen (/~thylalkohol, Methylbenzoat, Benzol, Paraffin) verursachten keine naehweisbare Aktivit~tsdepression. Nur bei Erhitzen der Pr~p~rate im Wasserbad trat oberhalb 60°C eine Aktivit~tsminderung ein, die mit steigender Temperatur und verI~ngerter Einwirkungszeit in vSlligen Aktivit~tsverlust fiberging. Dieses ungewShnliche VerhMtcn ermSglicht den Naehweis des Fermentes an gew6hnliehen Para/]inschnitten. Jedoch gestattet die yon MoLo~¥ u. Mitarb. angegebene Methodik keine befriedigende cytologische Auswertung yon Schnittpr/~paraten. Deshalb arbeite~en wir eine eigene Modifikation aus. Als Kupplungssalz benutzten wir das yon D~vis and OmCSTEZ~ angegebene hexazotierte Pararosanilin. Dies verbinder sieh mit dem Spaltprodukt des NaphthoLASD-CMoracetates zu einem wasserunl6slichen, leuehtend roten l~arbstoff und gewii~hrleistet eine sehr exakte Lokalisation der Fermentaktivit/~t. Praktiseh gehen wir folgendermaBen vor. Ein Tropfen 4%iges Pararosanilin in 2nHCI und ein Tropfen 4%ige w~Brige NatriumnitritlSsung werden vermiseht und nach eingetretener Hexazotierung (nuch 30--60 sec) mit 30 ml Miehae]ispuffer (0,1 M; pH 6.8--7,6) verdfinnt. Der pH-Wert wird unter pH-Meter-Kontrolle mit HC1 auf 6,3 eingesteltt. Dann werden 10 mg NaphthoLASD-Chlor-acetat in 1 ml Dimethytformamid aufgelOst. Beide LSsungen werden unter kr~ftigem l~fihren zusammengegeben, wobei ein milchiger, hellroter, flockiger Niederschlag auf~ritt. Das Filtrat ist jedoch klar und leicht rStlieh gef~rbt. In dieses Medium werden bei Zimmertemperatur mOgliehst diinne, dem Objekt.tri~ger gut anhaftende, in fiblicher Weise entparaffiniel%e Sehnitte eingestellt. Die .Inkubationszeit betr/igt 30rain. Naeh der Inkubation werden die Schnitte gut unter Leitungswasser abgespfilt, 5 rain in saurem H~malaun naeh M~.~E~ gegenge~rbt, gebl~ut und in Gelatinol eingedeckt. Auf diese Weise erzielten wir selbst in Schnitten yon 12 Ja.hre a lan formalinfixierten ParaffinbtSeken eine tadellose Reaktion. Aueh in Maximowscher LSsung fixiertes Untersuchungsgut erwies sich Ms geeignet. SchlieBhch liefert das Verfahren bei Blurund Knochenmarkausstrichen sowie Tupfpriiparaten (in Methanol-Formol nach I~rLow fixiert) und bei nativen Kryostatschnitten ausgezeichnete Resultate. l~ach Entkalkung mit Salzs~ure-Ameisensi~ure-Gemisch geht die Aktivit/~t im Knoehengewebe verloren, nicht dagegen bei Anwendung yon EDTA. Die angegebene Methodik hat mehrere Vorzfige. Dureh Verwendung yon Paraffinschnitten ist gegenfiber Gefrierschnitten aus nativem oder formolfixiertem Material eine se:hr viel bessere Erhaltung morphologischer Details erreicht. Hexazotiertes Pararosanilin als Kupplungssalz bewirkt eine exakte Lokalisation des Reaktionsproduktes bei fast vollkommen feh]ender Untergrundfi~rbung. Die leuehtend rote, sehr kr/iftige Anfiirbung hebt die positiven Zellen gegeniiber den negativen sehr deutlich hervor und kontrastiert stark zu den blau gefi~rbten Zellkemen. SchlieBlich ist die beim Verfahren yon MOLO~V.Y u. Mitarb. h/iufig ungleichm~Bige Anf~rbung yon sehr zelh'eichen Pr~paraten weitgehend verringert. Besonders vorteilhaft ist jedoch, dab die Reaktion an routinem~Big hergestellten Paraffinschnitten durchgefiihrt werden kann. Aui diese Weise ist es mSgtich, schneU und ohne zcitraubende spezielle Fixiernngsund Einbettungsverfahren Untersuchungsgut in beliebiger Menge zu erhalten. Unsere Beobaehtung ermSglicht eine rasche und sichere Orientierung fiber Menge und Verteitungsmuster der mit der Reaktion erfaBbaren Zetlen im Paraffinschnitt. Insbesondere abet gelingt es, die selbst bei Giemsa-Farbung im Schnittpr/iparat oft schwer yon anderen Zel]en abgrenzbaren nicht

Cytophotometrische Messung der Aktivität von Naphthol-AS-D-Chloracetat-Esterase in den normalen menschlichen basophilen Granulopoiesezellen

Citations

[Quantitation of basophil cell-line in human bone marrow (author's transl)].

The Origin of Blood Basophils

Myelopoese (Granulozyten, Monozyten)

References

Blutkrankheiten und Blutdiagnostik

The mast cells

Esterase activity in leukocytes demonstrated by the use of naphthol AS-D chloroacetate substrate.

Über die selektive fermentcytochemische Darstellung von neutrophilen myeloischen Zellen und Gewebsmastzellen im Paraffinschnitt

Lienert, G. A.: Verteilungsfreie Methoden in der Biostatistik. Verlag Anton Hain, Meisenheim am Glan 1962; X + 361 S., DM 39,50